De l’utilisation de biomarqueurs de maladies neurodégénératives pour le développement de tests de diagnostic précoce et de nouvelles stratégies thérapeutiques

Le terme de démence est un terme générique qui caractérise la perte progressive d’aptitudes mentales et physiques suffisamment graves pour entraver la vie de tous les jours. Plusieurs pathologies sont regroupées sous le terme de démence, comme les maladies d’Alzheimer (la plus fréquemment diagnostiquée, dans 60 à 80% des cas), de Parkinson, de Pick (également appelée dégénérescence frontotemporale, ou FTD) ou encore de Charcot (également appelée sclérose latérale amyotrophique, ou ALS). Ces maladies sont dites neurodégénératives car elles surviennent lorsque les cellules nerveuses (ou neurones) impliquées dans la cognition commencent à dégénérer. Il n’existe actuellement aucun test de diagnostic simple et de confiance, hormis une approche empirique basée sur l’évaluation des précédents familiaux, des changements psychomoteurs des patients, etc. ; il n’existe également aucune approche thérapeutique valide pour ces maladies, ce qui en fait un problème de société de premier ordre, particulièrement à la lumière du vieillissement global de la population. La recherche de biomarqueurs de ces maladies a connu, en 2011, une réelle avancée, avec la découverte d’une aberration génétique au niveau du chromosome 9, qui serait responsable de deux types de démence, la FTD (qui se trouve être la deuxième démence sénile la plus diagnostiquée) et l’ALS. Plus précisément, il a été découvert qu’une aberration dans le cadre ouvert de lecture 72 du chromosome 9, autrement noté C9orf72, est responsable de ces deux maladies : cette aberration se caractérise par une répétition anormale du motif hexanucléotidique GGGGCC (ou G4C2, avec G pour guanine, et C pour cytosine), avec 2 répétitions dans le cas d’une personne non-malade et des centaines voire des milliers de répétitions dans le cas de personnes malades. Ainsi, les répétitions du motif G4C2 offrent un biomarqueur génétique de choix pour ces maladies désormais rassemblées sous la dénomination commune de FTD/ALS. Dans le cadre de ce projet, nous nous proposons d’exploiter ce biomarqueur pour développer un test de diagnostique permettant une détection la plus précoce possible de ces dégénérescences (de façon à traiter ou limiter l’aggravation des symptômes par voie médicamenteuse ou comportementale) et pour identifier de nouveaux candidats médicaments pour lutter contre ces désordres neurologiques (selon une approche thérapeutique tout à fait innovante). Ainsi, après avoir décrit avec précision les connaissances acquises ce jour quant aux mécanismes génétiques sous-jacents à la FTD/ALS, qui impliquent des répétions G4C2 à la fois ADN et ARN (notées respectivement d[G4C2] et r[G4C2]), nous exploiterons ces données pour 1- étudier avec précisions les propriétés de ces répétions d’acides nucléiques d’un point de vue structural puisque les répétitions d’ADN et d’ARN riches en guanine sont connues pour adopter des structures tridimensionnelles telles que les G-quadruplexes ; nous étudierons la dynamique de cette structuration et l’exploiterons pour développer un test de détection de ces structures in vitro dans le but de diagnostiquer la FTD/ALS par quantification par fluorescence de la présence de ces biomarqueurs génétiques. Et 2- d’exploiter ce test de détection in vitro pour identifier des molécules capables de déstructurer les quadruplexes des répétitions d[G4C2] et r[G4C2], connues comme étant neurotoxiques, dans le but de découvrir puis étudier une approche thérapeutique innovante qui pourrait répondre à un besoin sociétal fort. Pour cela, notre projet s’appuie sur un consortium solide comprenant des équipes de recherches de Dijon (ICMUB), Orsay (Institut Curie) et Bordeaux (IECB) et s’organise selon un programme de travail défini qui exploitera au mieux l’expérience et l’expertise de ces équipes de recherche ainsi que leur complémentarité ; ce projet est donc innovant et ambitieux mais à faible risque, résolument interdisciplinaire et applicatif.

InsidePores
Le projet InsidePores propose une approche inédite pour la préparation de nanoparticules. Son originalité réside dans l'utilisation de matériaux supramoléculaires poreux spécialement conçus à cet effet. Au cours de ce projet, nous utiliserons les espaces confinés de ces matériaux poreux supramoléculaires pour la croissance de structures minérales comme des oxydes métalliques ou des métaux dont la taille, la forme et l’organisation spatiale seront dirigés par la porosité de l’hôte.

Une étape essentielle de ce procédé est l’insertion des précurseurs moléculaires des nanoparticules dans les pores de la matrice hôte. Il faut que cette étape soit efficace et rapide, mais il est également nécessaire que les molécules entrant dans la porosité établissent des interactions faibles avec les parois de l’édifice. Pour répondre à ces critères, les matrices sélectionnées dans InsidePores auront leurs parois fonctionnalisées par des groupements chimiques adaptés pour établir de telles interactions avec les précurseurs invités choisis. Deux architectures supramoléculaires poreuses et robustes ont d’ores et déjà été identifiées comme de bonnes candidates. L’une possède des canaux 1D, l’autre un réseau de pores 2D interconnecté dont le diamètre des pores est de 1,2 nm. Des résultats préliminaires montrent que ces structures pourront être modifiées pour fonctionnaliser leurs parois sans altération de leur intégrité structurale, les unités élémentaires de ces édifices pouvant être facilement modifiées.

InsidePores est un projet de recherche fondamentale dont l'ambition est de mettre au point une procédure chimique innovante pour la préparation de nano-objets de taille et de forme contrôlées. Le recyclage de la matrice est aussi pris en considération. Ce projet vise en premier lieu la préparation de nanoparticules de ZnO, matériau aux propriétés optiques intéressantes pour des applications comme les lasers UV ou des diodes bleues. Cette approche pourra, évidemment, être étendue à d’autres objets métalliques comme l’or ou l’argent pour la préparation de métamatériaux. Dans ce cas spécifique, conserver l’intégrité du système (i.e. conserver les nanoparticules dans la matrice) pourra s’avérer utile.

Les retombées radioactives faisant suite à l'explosion d'un réacteur de la centrale nucléaire de Tchernobyl et les fuites considérables d'eaux contaminées issues de la centrale nucléaire de Fukushima Daiichi endommagée par un tsunami ont soulevé des questions sur les risques de contamination radioactive des sols et systèmes aquatiques à proximité, et sur la nécessité de disposer d'un outil d'évaluation des dangers fiable en cas de libération de substances radioactives dans l'environnement. La mesure de niveaux à l'état de traces du plutonium dans l'environnement, typiquement à l'échelle femtomolaire de concentration, et d'autres métaux tétravalents, exige de disposer de techniques de séparation radiochimique poussées et de méthodes analytiques très sensibles. La technique DGT (gradient de diffusion dans des couches minces) est largement utilisée pour échantillonner les métaux à l'état de traces dans différents milieux, notamment les eaux retenues dans les sols et les sédiments. Elle a été employée avec succès pour le dosage des radioisotopes et d'autres radioéléments (134Cs, 137Cs, U, etc.). Dans l'état actuel, il n'existe pas de DGT capable de permettre de différencier les espèces tétravalentes (An4+) des cations de transition di- ou trivalents. Nous proposons donc de mettre au point des résines spécifiques de An4+ utilisables dans des environnements physico-chimiques variés. À cet effet, il est indispensable de concevoir et de sélectionner les chélateurs optimaux qui devraient montrer de très hautes affinités et sélectivités envers les éléments tétravalents par rapport aux autres métaux, aux pH des eaux naturelles. Les propriétés des chélateurs par rapport à la complexation des métaux en solution seront déterminées des points de vue structuraux et thermodynamiques en vue d'évaluer leur efficacité en termes de sensibilité et de spécificité. Dans l'étape suivante, ces ligands seront greffés sur des polymères organiques pour fournir des résines chélatantes originales utiles pour la séparation à des fins analytiques et pour la fabrication de dispositifs de type DGT inexistants jusqu'à présent. Les capacités de pré-concentration de l'outil analytique DGT seront ensuite validées pour Pu(IV) et d'autres métaux tétravalents en laboratoire et en conditions environnementales réelles (tests de terrain). Le partenaire industriel aura pour mission ultime de produire et de commercialiser les résines et les dispositifs DGT développés dans le cadre de ce projet.

Porteur de projet : Dr Michel Meyer

Les bioconjugués sont devenus des outils essentiels à la recherche biomédicale, au diagnostic et à la thérapie. Une nouvelle génération de bioconjugués commence à apparaître. Il s'agit de protéines doublement modifiées, qui possèdent des propriétés optimisées et/ou qui permettent de nouvelles applications telles que l'imagerie bimodale et le théranostic. Ainsi, au cours de ces dernières années, les agents d'imagerie bimodaux, qui associent sur un même biovecteur une sonde fluorescente pour l'imagerie optique et un agent chélatant des radiométaux pour l'imagerie nucléaire (TEP ou TEMP), se sont multipliés. Certains d'entre eux sont d'ores et déjà testés en clinique comme assistants à la chirurgie. Des avancées significatives ont également été effectuées dans le domaine des conjugués Médicament-Anticorps (ADC). En particulier, la conjugaison de plusieurs médicaments cytotoxiques sur un même anticorps ou d'une sonde d'imagerie à un ADC, permettent d'obtenir des ADC aux propriétés nouvelles ou optimisées. 

Le développement de ces nouveaux bioconjugués est actuellement seulement limité par les difficultés techniques associées à leur production. Un intérêt croissant est apparu, au cours de ces dernières années, pour le marquage dit « site-spécifique » des anticorps. En effet, celui-ci permet l’obtention de conjugués parfaitement définis, de façon plus reproductible et avec un meilleur contrôle du ratio de marquage. Ces éléments facilitent, in fine, la mise sur le marché de ces bioconjugués. Cependant, réaliser un tel double-marquage, de façon site-spécifique, sur un anticorps (ou une protéine en général) réclame un très haut degré de technicité. Par conséquent, la découverte de nouvelles technologies, qui permettraient de simplifier le double-marquage des protéines, serait à même de conduire une explosion de cette seconde génération de bioconjugués et leur utilisation sur le marché. Ces nouveaux outils devraient posséder les caractéristiques suivantes : ils devraient être i) simples d’emploi, ii) site-spécifiques, iii) tolérants et biocompatibles et enfin iv) modulaires. 

Le projet ZINELABEL vise à développer une petite plateforme ternaire, robuste et modulaire appelée dichloro-s-tétrazine, capable de permettre le double marquage site-spécifique des protéines dans des conditions douces et biocompatibles. La réactivité du motif dichloro-s-tetrazine sera utilisée pour préparer une librairie de dérivés mono- et di-substitués, via l’introduction de différents marqueurs (sondes fluorescentes proche infrarouge, agents chélatant macrocycliques, chaines PEG, agents de ciblage). La capacité de ces tétrazines à réagir avec des diénophiles via une réaction de type iEDDA sera également étudiée. Cette plateforme tétrazine sera ensuite utilisée pour i) marquer, de manière site-spécifique, un Affibody pour l’imagerie optique+nucléaire, et ii) marquer un aptamère protéique ciblant la protéine HSP70. Ces preuves de concept nous permettront de démontrer le potentiel de la technologie ZINELABEL pour le double marquage, simple et efficace, des protéines.

Les neurotoxiques organophosphorés (OP) sont malheureusement utilisés comme agents de guerre chimiques et comme pesticides. Considérant la menace sérieuse qu'ils représentent pour la sécurité et la santé dans le monde, de nombreux efforts ont été consacrés au développement de dispositifs sensibles et sélectifs pour leur détection. De nos jours, aucune des stratégies développées n'a conduit à un système de détection à la fois sensible, rapide, portable, robuste, fiable, universel et visuel. Le projet DetectOP-BChE vise à mettre au point un tel dispositif en concevant un système d'alerte à l'égard des OP et un outil avancé pour identifier la nature des OP responsables de l'alerte. Les deux systèmes sont complémentaires et seront conçus en un seul appareil. La stratégie est basée sur le concept de fluorescence/colorimétrie sensible, visuel et simple d'utilisation, associé aux caractéristiques des cholinestérases en tant que biomarqueurs rapides et sélectifs d'une exposition aux OP. Ce nouveau système de détection des OP devrait permettre de réduire considérablement la problématique des faux-positifs, permettant ainsi d'accroître la fiabilité du système, et d'atteindre des limites de détection basses. Les dispositifs du projet DetectOP-BChE seront appropriés à la protection des troupes militaires des Forces armées françaises et étrangères ainsi qu'à la protection des sauveteurs et des civils dans le cadre de l'utilisation détournée des OP dans les conflits militaires et les attaques terroristes. Les OP étant également utilisés comme pesticides, ces dispositifs seront aussi adaptés à la protection du personnel et des chercheurs des industries chimiques et des agriculteurs.

Porteur de projet : Pr. Anthony Romieu

Au cours des dernières années, les s-tétrazines ont fait l'objet d'un intérêt considérable dans divers domaines de recherche d'importance primordiale. Ceux-ci incluent le développement de matériaux fonctionnels pour des applications dans les domaines de l’énergie et de la santé. Cependant, la préparation synthétique de s-tétrazine hautement fonctionnalisée reste extrêmement limitée. Elle repose principalement sur la synthèse de Pinner à partir de tétrazines halogénées ou d'arènes peu fonctionnalisés, montrant de sérieuses limitations synthétiques. Le présent projet vise maintenant à fournir de nouvelles sélectivités dans l'activation C–H de s-aryltétrazine par des métaux de transition permettant d’atteindre des fonctionnalisations plus éloignées du noyaux tétrazine en méta et para avec des réactifs électrophiles et nucléophiles : Les tétrazines ciblées couvrent un large domaine d’application des matériaux moléculaires ou molécules bioactives. Une étude mécanistique approfondie sera réalisée par électrochimie analytique et des études DFT, afin de résoudre le problème de la compatibilité avec les étapes de limitation de vitesse (OA, RE, TM) et des réactifs dans le processus de réaction.

Porteur de Projet : Dr. Julien ROGER

Parmi les différentes approches d'imagerie médicale, l'imagerie moléculaire représente un outil puissant, permettant de détecter des changements physiologiques très fins au niveau cellulaire et moléculaire. Même si elle joue un rôle central en oncologie, l'imagerie moléculaire possède également de nombreuses autres applications, telles que les maladies cardiovasculaires, les infections, les désordres osseux, la maladie d'Alzheimer, les troubles pulmonaires, etc... C’est la méthode de choix pour réaliser des études in vitro et ex vivo, et de plus en plus in vivo sur petit animal. Elle est également très utilisée en milieu clinique pour les investigations par endoscopie, ainsi que pour la chirurgie guidée par imagerie de fluorescence, même si malheureusement ses applications sont plus limitées dans ce domaine, à cause de sa faible pénétrabilité dans les tissus.

L'intérêt croissant pour l'IO est également dû à deux domaines émergents : l'imagerie bimodale et le développement d’agents thérapeutiques traçables. Tout d’abord, la combinaison de l’OI avec l’imagerie TEP ou TEMP, permet de coupler deux techniques complémentaires et de sensibilité comparable, et ainsi bénéficier de la haute résolution de l’OI avec la forte pénétrabilité de la TEP et TEMP. En ce qui concerne les agents thérapeutiques traçables, le greffage d'une sonde fluorescente sur un fragment thérapeutique permet de suivre en temps réel le comportement du composé in vitro et in vivo, permettant ainsi d’obtenir des informations cruciales sur sa biodistribution ainsi que sur son mécanisme d’action.

Dans le but d'effectuer des études in vivo, l'utilisation de la lumière proche infrarouge (NIR) présente plusieurs avantages, tels qu'un faible coefficient d'absorption de la plupart des biomolécules, une diffusion plus faible, une minimisation des signaux d'auto-fluorescence et des risques de perturbation des systèmes biologiques à étudier, et nécessite donc l'utilisation de sondes fluorescentes absorbant et émettant dans la "fenêtre thérapeutique" (entre 650 et 900 nm). Cependant, le choix de ces fluorophores est presque toujours limité à l’utilisation des cyanines, qui, malgré des nombreux avantages, souffrent d'une faible efficacité de fluorescence, mais surtout d'une instabilité chimique, et d'un photoblanchiment rapide. Ainsi, actuellement, il n’existe pas de sonde fluorescente émettant dans le proche infrarouge, idéale pour les applications biologiques (hydrosoluble, stable, peu toxique ...), permettant un large éventail de fonctionnalisations, et pouvant être synthétisée à grande échelle.

Nous proposons de répondre à cette problématique, et de développer une plateforme fluorescente NIR présentant les propriétés précitées. Dans ce but, nous ciblons une famille de fluorophores prometteuse, et beaucoup moins explorée que les cyanines, les aza-BODIPY, car leur synthèse est très accessible : ils absorbent et émettent dans la région NIR, et surtout ils présentent une stabilité chimique et photochimique exceptionnelle. Par conséquent, les composés aza-BODIPY présentent tous les avantages pour les applications biomédicales, à l'exception de leur caractère lipophile élevé et de leur très faible solubilité. C'est pourquoi, nous développerons une stratégie simple pour les solubiliser, et plus particulièrement nous allons élaborer une plateforme aza-BODIPY hydrosoluble, hautement fonctionnalisable. À partir de cette plateforme, nous concevrons de nouvelles sondes multimodales monomoléculaires (MOMIP) pour la TEP-SPECT/OI, et des agents thérapeutiques traçables. Les systèmes les plus prometteurs seront bioconjugués à différents biovecteurs, et dans la dernière partie, nous démontrerons, à travers une étude pilote d'imagerie, le potentiel et la valeur ajoutée de ces nouveaux systèmes.

Porteuse de projet : Dr Christine Goze